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一种研究RNA与蛋白质的相互作用的实验方法

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一种研究RNA与蛋白质的相互作用的实验方法详细介绍

➤一种研究RNA与蛋白质的相互作用的实验方法属于项目合作中的医药项目合作(*)

 RIP 的基本原理
  1.  用抗体捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。

  2. 免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。

  3. 结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。

实验方法

01

 蛋白A琼脂糖凝胶和抗体的固定

  1. 取被protein-A包裹的磁珠悬浮液,先用PBS洗涤,然后用NT2缓冲液洗涤磁珠两次。

  2. 将NT2缓冲液和BSA添加到磁珠悬浮液中,在室温下搅拌培养2小时。

  3. 将抗体添加到上述步骤得到的混合物中,然后在室温下孵育1小时。

  4. 用NT2缓冲液洗涤protein-A包被的磁珠,然后搅拌3min,1000g,离心1min,重复此过程5次。

02

 细胞裂解物的制备

  1. 将细胞先转移至离心管,然后在4℃,1000g,离心10min;

  2. 细胞用预冷的PBS洗涤两次;

  3. 加入与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,轻轻地吹打均匀于冰上静置5min;

  4. 每管分装400 μL细胞裂解液,于-80℃冰箱保存;

03

 免疫沉淀反应

  1. 将上述步骤得到的细胞裂解液4 °C,14000 g,离心10 min;

  2. 取清液到一个新的离心管中,4 °C,14000 g,离心5 min,再将上清液再转移至另一个新的管子中;

  3. 在制备的上清液中加入10倍体积的NET-2buffer重悬的磁珠,吹打混匀;

  4. 取约10%的样品作为“Input”备份,−80 °C保存备用;

  5. 在裂解液中加入10倍体积的NET-2 buffer重悬的磁珠,作为阴性对照;

  6. 接着在4℃恒温搅拌下孵育12-16h;

  7. 孵育后,离心分离protein-A包被的磁珠,取出10%上清备份“output”;

  8. 用NT2缓冲液洗涤磁珠,将其重悬后并混合3min,然后4℃,1000 g离心,重复6次。

RNA的分离与分析

  1. 将Trizol加入到等体积的磁珠中,并将混合物重新悬浮,RNA立即被分离或冷冻在液氮中。

  2. 检测RNA的浓度和质量,并通过RT-PCR和测序鉴定RNA.

RIP实验中常见问题及解决办法

  1. 非特异性RNA的结合过高

    在室温下搅拌培养2小时,可以减少mRNA与磁珠的非特异性相互作用。

  2. 分离得到的RNA水平过低

    实验过程中需确保细胞中有足够水平的蛋白质。

 TEL:13718279886

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